"三區劃線法"是一種在實驗室中常用的平板劃線接種技術，主要用於分離和純化細菌。該方法的操作過程可以概括為：
起始區域：在平板的起始位置反覆劃線，然後以之字形的方式進行劃線。這一區域的劃線區域不超過平板的1/3。
第二區域：將平板旋轉60度，然後以之字形的方式進行劃線。最初的幾條線應與第一區域的右側末端交叉，之後連續劃線不再與第一區域接觸。
第三區域：再次將平板旋轉60度，按照與第二區域相同的規則進行劃線。
通過這種方式，各個區域首尾相接，菌量逐步減少，最終達到在每個區域形成單個菌落的目的。這種方法的關鍵在於通過劃線操作控制細菌的數量，使得每個區域只形成一個菌落，從而實現細菌的分離和純化。
在實際操作中，如果無法形成單菌落，可能是由於沒有充分利用好劃線區域、各區域線過於密集、與前一區交叉過多、劃線時接種環接觸點變動、未掌握好劃線力度與角度導致劃破瓊脂，或者待接種的細菌菌量過多等原因。
需要注意的是，「三區劃線法」與「三區三線」是兩個不同的概念。後者是國土空間用途管制分區的一種劃分方式，與實驗室的細菌分離技術無關。