三引物法是一種用於鑑定純合突變體的PCR技術，具體包括以下步驟和原理：
設計引物：
LP（Left genomic primer）：位於T-DNA的上游基因組序列上，即5'端。
RP（Right genomic primer）：位於T-DNA的下游基因組序列上，即3'端。
BP（Border primer）：位於T-DNA上，用於識別T-DNA插入的位置。
PCR擴增：
在野生型中，由於沒有T-DNA插入，只有LP+RP的PCR產物。
在突變體中，由於T-DNA插入，LP和RP不能成功擴增，只有BP+RP的PCR產物。
在雜合體中，兩條帶都有。
實驗步驟：
第一次PCR（tier-1）：使用LP和RP引物，如果出現陽性的小分子量PCR條帶，則說明存在染色體刪除。
第二次PCR（tier-2）：使用結合於T-DNA外側及內部的一對相向引物，無PCR條帶則說明缺失正常的T-DNA序列。
結果解讀：
如果兩次PCR均無陽性結果，則可能為野生型。
如果第一次PCR陽性，第二次PCR無陽性，則可能為純合缺失突變體。
注意事項：
提取DNA時，如果種子播種較多，可以進行混葉檢測。
引物需要離心後使用，並妥善保存。
通過上述方法，可以有效地鑑定出純合缺失突變體。