分子克隆是一套技術，涉及將來源於真核或原核生物的重組DNA插入到一個可以複製的載體中，如質粒或病毒載體。這個過程包括製備大量拷貝的目的DNA片段，這些片段可以是基因或其他DNA序列，它們可以來自原核、真核或已絕跡的生物，或者人工合成。分子克隆的目的是對基因的功能有更多了解，以及生產該基因編碼的蛋白質。
在分子克隆中，首先需要準備兩種重要的DNA分子：想要克隆的DNA片段（插入片段）和載體（通常是質粒）。質粒是一種獨立於染色體外的環狀DNA，可以在細菌內複製。質粒含有多個克隆位點（MCS），不同的插入片段可以通過連線技術被整合到質粒中。質粒還包含複製原點和抗生素抗性基因，以便在細菌內複製和篩選成功轉化的細菌。
分子克隆的操作步驟包括：
獲得目的片段，可以是任何細胞類型的DNA或mRNA。
使用PCR等方法複製插入片段。
通過酶促反應將插入片段和載體連線。
將重組DNA導入宿主細胞（如大腸桿菌）以得到大量複製。
從細菌中純化複製後的載體，並進行限制性酶消化和電泳分析。
膠純化得到的片段送去測序以驗證插入片段是否為所需DNA片段。
分子克隆可以用於DNA和cDNA克隆。cDNA克隆是以mRNA為原材料，通過體外反轉錄合成互補的DNA（cDNA），再與載體DNA分子連線引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。