革蘭氏染色法的原理基於細菌細胞壁的組成和結構的差異。
革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖組成，且結構較為緻密，而革蘭氏陰性菌的細胞壁則以磷脂為主，含有較薄的肽聚糖層和一層較厚的外膜。在染色過程中，首先使用結晶紫染液對細菌進行初染，隨後用碘液進行媒染，這會在細胞壁內形成不溶於水的結晶紫與碘的複合物。接著使用乙醇進行脫色處理，這時，革蘭氏陽性菌因其細胞壁較厚和肽聚糖網層次較多，能夠牢牢保留結晶紫與碘複合物，使其仍呈紫色。相比之下，革蘭氏陰性菌的細胞壁較薄，外膜在乙醇作用下迅速溶解，導致肽聚糖層無法有效保留複合物，隨後使用紅色染料進行復染，革蘭氏陰性菌呈現紅色。
通過這種差異，革蘭氏染色法能夠將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩大類。這種染色方法不僅有助於觀察細菌的形態，還對臨床診斷和治療由細菌感染引起的疾病具有重要意義。