《芭比之公主學院》是一部以人物眾多的特點而聞名的卡通片，其主要角色包括：
蘇非婭公主/布萊爾·威羅斯。由芭比扮演的蘇非婭公主是故事的核心理人物，她實際上是已故女王伊莎貝拉的女兒。蘇非婭的身份在故事中被揭示，她與德溫女公爵的鬥爭成為主線。
德蘭西·德溫。一個驕傲的大小姐，最初對蘇非婭持鄙視態度，但後來在了解真相後成為她的盟友。
普里懷特校長。一位通情達理的校長，對蘇非婭的成長和身份揭露起到了關鍵作用。
德溫女公爵。為了讓自己女兒成為統治者而不擇手段的邪惡角色，故事中的反派人物。
尼古拉。鄰國的王子，他在一次偶然的機會下與蘇非婭相遇，並被她的善良和活潑所吸引。
艾斯拉和海莉。蘇非婭的好朋友，他們分別對運動和音樂充滿熱情，在故事中扮演了重要角色。
該卡通片講述了蘇非婭如何在朋友們的幫助下揭露德溫女公爵的陰謀，並最終成為加誕尼亞的新任統治者的故事。