靛胭脂染色的原理主要基於色素對比，通過將靛胭脂染色劑注入或噴灑在體內腔道的黏膜表面，如結腸和胃，來顯示黏膜的細微結構和病變。在正常情況下，胃黏膜或結腸黏膜表面是光滑的，呈現橘紅色。當有炎症、潰瘍或癌變等病變時，黏膜表面會出現變化。靛胭脂染色劑能夠沉積在黏膜的皺襞溝紋和胃小凹間，與原本的橘紅色黏膜形成鮮明對比，從而在胃鏡或結腸鏡下更容易發現黏膜的凹凸變化和立體結構。
通過靛胭脂染色，醫生可以更準確地診斷和篩查早期病變。如果病變邊界不清，通常認為是炎症性病變；如果邊界清晰且有不規則形態改變或異常，則可能需要進一步檢查，如活檢，以明確病變的性質。研究表明，靛胭脂染色結腸鏡檢出率高於常規結腸鏡檢出率，說明靛胭脂染色在診斷微小病灶方面的優勢。
靛藍胭脂紅作為一種氧化還原指示劑和酸鹼指示劑，能夠在氧化還原反應和pH值變化下顯示不同的顏色，但其具體作用機制在靛胭脂染色中並不是主要的關注點。