UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）的作用原理主要涉及對含有dU（脫氧尿嘧啶）的雙鏈或單鏈DNA進行選擇性水解，斷裂尿嘧啶糖苷鍵。這一過程形成缺失鹼基的DNA鏈，這些DNA鏈在鹼性介質和高溫下會進一步水解斷裂，最終被消除。
UNG酶在PCR（聚合酶鏈式反應）中有著重要的套用，通過在PCR反應中用dUTP替換一部分dTTP，可以使擴增產物中的胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）取代，從而形成含dU的PCR產物。UNG酶能夠識別並切割這些含dU的DNA鏈，有效消除PCR產物的殘留污染，減少因擴增產物污染導致的假陽性問題，保證擴增的特異性和準確性。
此外，UNG酶的最佳活性溫度約為50℃，在95℃時失活，這一性質使其在特定條件下發揮作用，同時避免對後續反應的影響。