分辨三線鼠的公母可以通過以下幾種方法：
生殖器與肛門的距離。公三線鼠的生殖器與肛門的距離較遠，且中間有毛；母三線鼠的生殖器與肛門的距離較近，兩點間沒有毛。
香腺。公三線鼠的香腺較爲明顯，尤其是在發情期時會分泌黃色分泌物；母三線鼠的香腺不太明顯。
乳房。母三線鼠的乳房比公鼠更明顯。
體型和外觀。成年公鼠通常體型較大，屁股大而圓，肛門長而大；母鼠的屁股呈倒三角形，肛門緊閉。
乳頭。從出生到大約20天時，可以通過觀察是否有乳頭來判斷性別，能看到乳頭的是母鼠。
這些特徵在幼鼠時期可能不夠明顯，但隨着它們成長，這些差異會變得更加容易辨認。