孢子染色的原理主要基於不同類型的微生物，如細菌和真菌，其孢子的結構和化學性質不同，導致對染色劑的反應也不同。以下是孢子染色的原理：
細菌的芽孢。芽孢是細菌的一種休眠形式，具有厚而緻密的壁，通透性低，不易著色。因此，使用著色力強的染料，如孔雀綠或鹼性品紅，在加熱條件下進行染色。這樣，染料可以進入芽孢，而菌體中的染料則可以通過水洗被洗脫。然後，使用對比度大的復染劑，如番紅，對芽孢進行復染，使得芽孢保留初染劑的染色，而菌體則呈現不同的顏色，便於區分。
真菌的孢子。孢子是真菌的繁殖體，其內部成分（如小核）與真菌體外的成分不同，對染色劑有不同的反應。在染色過程中，常用的染色劑以燕麥粉等營養物質為基礎，通過特殊處理後塗抹在真菌樣本上。這些染色劑可以讓細胞的部分區域變為不透明，然後進行觀察。孢子的內部分子化學性質不同，染色劑對孢子內部分子的作用能力更強，因此染色劑可以滲透到孢子內部而顯現出陽性顏色。
需要注意的是，在進行孢子染色過程中，需要先對孢子進行適當的處理，如磨碎或波動、高溫處理等，以增加染色劑對孢子的反應。同時，染色劑配方也需要根據不同的孢子類型進行調整，以達到更加準確的染色效果。