寡核苷酸是一類由多個核苷酸通過磷酸二酯鍵連線而成的生物大分子，其合成主要通過化學方法進行，尤其是基於亞磷醯胺化學的固相合成法，這種方法包括四個基本步驟：
脫保護。首先，使用化學試劑去除前一個核苷酸上的保護基團，暴露出5'-羥基。
偶聯。接著，活化後的亞磷醯胺單體與5'-羥基反應，形成新的磷氧鍵，從而延長核苷酸鏈。
氧化。偶聯反應後，需要進行氧化或硫化處理，使磷酸二酯鍵穩定。
加帽。最後，對未參與反應的5'-羥基加帽，防止其進一步參與反應。
這一過程在固相載體上進行，可以合成具有特定序列的寡核苷酸。合成完成後，需要通過氨解將寡核苷酸從固相載體上切割下來，並進行純化和超濾換液過程，以去除未反應的試劑和副產物。
寡核苷酸的合成需要嚴格控制溫度、pH值、底物質量等因素，以確保合成效率和產物的純度。隨著序列長度的增加，合成的難度和錯誤率也會上升，因此長序列的寡核苷酸合成具有較大的挑戰性。