革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：
初染。塗片固定，細菌塗片經火焰固定，加結晶紫染液染1分鐘，清水衝去染液。
媒染。加碘液媒染1分鐘，水洗，甩乾。
脫色。用95%乙醇脫色，輕輕搖動約20-30秒，至無紫色洗落為止，水洗，甩乾。
復染。加稀釋石炭酸復紅或沙黃染液數滴進行復染，約30秒，水洗。
乾燥後，置油鏡觀察。革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過於密集的細菌，常常呈假陽性。
革蘭氏染色的關鍵在於嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。