蜘蛛的性別可以通過多種方法來區分，以下是一些常用的方法：
觀察蛻的皮。成年蜘蛛蛻皮後，可以觀察皮的內面。雌性蜘蛛的蛻皮上有明顯的特徵，如在4個白點（書肺）中間有一個小片，而雄性蜘蛛的蛻皮則較為光滑，只有一條不明顯的細線。
觀察腿和牙齒的比例。成年蜘蛛的腿和牙齒可以反映其性別。雌性蜘蛛的第2和第3對足（從末端數）的第3、4節之間有較大的比例差距，第4節明顯比第3節長且細，且在兩個關節處有明顯轉折。雄性蜘蛛的腿和牙齒也有明顯特徵，雌性蜘蛛的腿和牙齒的根部較粗，與頭蓋的寬度比例較小，而雄性蜘蛛則相反。
觀察花紋和顏色。雌性蜘蛛的肚子上有一種白色花紋，而雄性蜘蛛的白色花紋中還有黑色花紋。此外，雄性蜘蛛的身體顏色通常較鮮艷、富有光澤，而雌性蜘蛛則較為暗淡。
觀察生殖器官。在蜘蛛腹部有兩對書肺，前面一對書肺的中間有一條略為下陷的橫紋，這條橫紋前方是生殖器的開口。雄蛛及未成熟的雌蛛生殖口的構造不明顯，而成熟雌蛛的生殖口則特化成較硬的構造，稱作外雌器。最準確的判定是雄蛛在成熟後，它毒牙旁的觸肢末端會有一個精栓，且第一對步腳的脛節上會有一根小凸起物，雌蛛則無這兩個構造。
這些方法適用於不同大小的蜘蛛，且在某些情況下，如觀察蜘蛛蛻的皮和觀察腿和牙齒的比例，需要藉助顯微鏡進行觀察。