《刺客信條3》的故事發生在18世紀末至19世紀初的美國殖民時期，主要講述了主人公康納·麥爾斯的故事。
康納是一個被培養成刺客的孤兒，他的父母都是刺客組織的成員，而他也被組織寄養在兄弟會中接受訓練。然而，隨著他的成長，他開始對奴隸制產生質疑，並最終逃離了兄弟會，成為了一名反抗軍戰士。
在遊戲的主線故事中，康納需要同時扮演刺客和逃亡者的雙重角色，通過刺殺目標獲取情報，同時通過各種手段逃避追捕和完成任務。此外，他也需要和追捕者進行鬥爭，不斷尋找自己的道路和目標。
故事的最後，康納成功幫助反抗軍解放了南方的一座城市，並在勝利慶典後與愛人希雅德一起離開了美國。在遊戲的大結局中，康納收到了來自過去自己的信件，揭示了未來奴隸制的悲劇，這促使他繼續在兄弟會中活躍，投身於消滅叛徒的任務，以保護刺客信條的傳承。這個故事講述了一個勇敢的刺客如何在歷史的洪流中掙扎、成長和改變，最終成為一個有責任感和使命感的英雄。