ATP水解酶的主要作用是催化三磷酸腺苷（ATP）水解為二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根離子，從而釋放出大量的能量。這一過程不僅釋放能量，還可能涉及磷酸基團的轉移，對細胞內的多種生化反應至關重要。
ATP水解酶在多種生物過程中發揮作用，例如，在肌肉收縮、神經信號傳遞和細胞生長等方面扮演著關鍵角色。這些酶通常位於生物膜上，利用ATP水解產生的能量進行工作。例如，某些ATP酶需要ATP水解產生的能量來逆著熱力學上更容易發生的方向進行物質運輸，即將物質從低濃度區域運輸到高濃度區域，這一過程稱為主動運輸。
此外，ATP水解酶還參與細胞的多種重要功能，例如信號轉導和基因表達調控。在這些過程中，ATP水解酶通過釋放能量或提供磷酸基團，對細胞的生命活動產生深遠影響。