《生化奇兵3》的故事發生在哥倫比亞城，這座城市是1920年代美國城市的縮影，融合了希望、夢想和恐懼。然而，城市中的槍火和暴力卻永無止境。哥倫比亞城正在面臨一個選擇：繼續在罪惡和腐敗的泥潭中掙扎，或者通過犧牲一些人，將希望傳遞給未來。
故事的主角是威廉·B·華盛頓，俗稱“哥倫比亞的獵魔人”。他是一個半人半機械的混合生物，擁有強大的力量和戰鬥力，同時也有一顆善良的心。在他的冒險中，華盛頓面臨著各種挑戰，包括他自己的黑暗過去和惡魔般的敵人。
同時，遊戲還包含了對前作的一些前情補充和新的劇情。包括一些揭示主角威廉父親的故事以及他的遺留物品等，增加了玩家對前作的回憶和代入感。不過需要提醒的是，遊戲包含一定的暴力場面和血腥情節，請謹慎選擇遊玩。