超級馬里奧兄弟系列遊戲中的主要角色包括：
馬里奧。一位勇敢堅毅的水管工，是任天堂的招牌角色，自上世紀80年代以來，一直是大多數馬里奧系列遊戲的主角。
路易基。馬里奧的雙胞胎弟弟，性格內向低調，最早設計出來是為了給2P操作的玩家使用的，在《路易鬼屋》中擔任過主角。
碧琪公主。馬里奧的戀人，經常被庫巴綁架，然後在遊戲中需要馬里奧來拯救她，在《超級碧琪公主》中，碧琪公主親自上陣，展現了她強大的戰鬥能力。
庫巴。惡霸國王，馬里奧的死對頭，主要負責綁架碧琪公主，令人驚訝的是，在《超級紙片馬里奧》中，庫巴與馬里奧聯手拯救了世界。
耀西。作為馬里奧的坐騎而設計，是一個溫和活潑的龍類角色，耀西是類物種的總稱，不僅僅指一個個體，在《耀西的手工世界》中，耀西擔任了主角。
瓦里奧。一個貪婪奸詐的淘金者，最初作為馬里奧的競爭對手和死對頭設計出來，由於人氣很高，在《瓦里奧大陸》中自立門戶成為主角。
瓦路易基。設計為路易基的死對頭，通常是遊戲中湊數的角色，例如在賽車和網球遊戲中，儘管沒有正式擔任過官方主角，但在同人遊戲《超能瓦路易》中，瓦路易基終於有機會成為主角。
奇諾比奧。作為遊戲中的後勤大師，負責送禮物、賣道具、給提示等任務，在《奇諾比奧隊長》中，奇諾比奧終於成為了主角，不再只是負責後勤。