共聚焦原理是一種在光學顯微鏡中使用的技術，主要用於提高解析度和對比度。其基本原理如下：
使用一個光源和兩個針孔（照明針孔和探測針孔）來實現點照明和點探測。來自光源的光通過照明針孔發射，並聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點發出的螢光或反射光成像在探測針孔上，由於照明針孔與探測針孔對被照射或被探測點是共軛的，因此可以提高解析度並排除臨近物點的影響。
在共焦掃描成像中，只有一個物點參與成像，通過掃描系統在樣品焦平面上進行掃描（X-Y掃描），從而產生一幅完整的共焦圖像。此外，通過調整樣品沿Z軸的位置，可以獲得樣品不同層面連續的光切圖像。
共聚焦顯微鏡使用雷射束作為光源，雷射束經過照明針孔和分光鏡反射至物鏡，並聚焦在樣品上。樣品中可被激發的螢光物質發出的螢光，經過原光路反向回到分光鏡，並通過探測針孔聚焦後到達探測器，從而在計算機上顯示圖像。