分光光度法的原理是基於物質對光的選擇性吸收特性。
在分光光度計中，使用一個可以產生多個波長的光源，通過一系列分光裝置，產生特定波長的光源。當光線透過測試樣品後，部分光線被吸收，樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。根據Lambert-Beer定律，溶液對單色光吸收的多少與溶液的濃度及溶液厚度（光路長度）之間的關係被闡明。即吸光度A與溶液的濃度c和溶液層厚度l（吸光係數已知）的乘積成正比。
在實際套用中，首先測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜），確定最大吸收波長，然後以此波長的光為光源，測定一系列已知濃度溶液的吸光度，作出吸光度-濃度工作曲線。在分析未知溶液時，根據測量的吸光度，查工作曲線即可確定出相應的濃度。
此外，分光光度法不僅用於測量樣品濃度，還可以用於檢測樣品中的雜質或污染物，以及確定化學反應的速率。