分光光度計的原理主要基於比爾-朗伯定律和光譜學原理。
分光光度計通常使用可見光或紫外光作爲光源，光源發出的光經過光學元件如準直器和光柵，以確保光束的均勻性和穩定性，當光束穿過樣品室中的待測溶液時，溶液中的溶質會選擇性吸收特定波長的光，這個吸收特性與溶質的濃度呈正比關係，通過測量樣品溶液對特定波長光的吸光度，可以定量分析溶液中的化合物濃度。
在測量過程中，通常會進行參比測量和樣品測量，參比測量用於校準儀器和補償背景光，樣品測量則用於測定待測溶液的吸光度。分光光度計還配備光柵或棱鏡等光譜分離裝置，將進入檢測器的光束分解成不同波長的光，以便測量各個波長處的吸光度。檢測器將檢測到的光強度轉換爲電信號，並傳輸給計算機或數據記錄設備進行處理，通過比較樣品和參比的吸光度，可以計算出樣品的濃度或其他所需的分析結果。