分光光度計的工作原理基於物質對光的吸收具有選擇性。不同物質都有各自的特徵吸收光譜，當光源通過分光裝置（如稜鏡或光柵）分離成不同波長的光，照射到樣品上時，樣品中某些波長的光會被吸收。這些被吸收的光線的強度與樣品的濃度成正比，因此可以通過測量樣品的吸光度來定量分析樣品的濃度。
分光光度計的基本構成包括光源、分光器件（如稜鏡或光柵）、樣品池、檢測器（如光電管或光電池）和測量系統。光源發出的白光通過分光器件後，會形成一系列單色光，這些單色光通過樣品池後，被樣品吸收，剩餘的光通過檢測器產生電信號，該電信號可以指示樣品的吸光度。
此外，分光光度計還遵循朗伯-比爾定律，即在一定波長下，溶液中物質的濃度與光能量減弱的程度有一定的比例關係。這使得分光光度計能夠用於定量分析不同物質。