熔解溫度
引物TM值，即熔解溫度（melting temperature），是指將一半量的雙鏈DNA解離成單鏈時所需要的溫度。這個溫度在一定程度上體現了雙鏈DNA的穩定性，並且是引發PCR反應的參考溫度。在PCR反應中，所有的引物都在同一個體系中反應，因此，反應中的所有引物必須具有相似的Tm，這樣才能保證每個擴增反應都能在選定的溫度下進行。
Tm值的計算公式為：
Tm = 4℃(G + C) + 2℃(A + T)
其中，G和C代表嘌呤鹼基，A和T代表嘧啶鹼基。這個公式適用於長度為20 mer及以下的引物。不同序列的DNA，其Tm值不同，DNA中G-C含量越高，Tm值越高，兩者之間呈正比關係。Tm的範圍一般在52-58℃之間，當Tm＞65℃時，引物有二次退火的傾向。