螢光分光光度計的原理是將樣品置於「致螢光試樣室」中，照射紫外線或藍色光線，使樣品分子被激發成為激發態，當樣品分子回到基態發出螢光時，螢光信號被螢光分光光度計所探測，樣品的螢光強度與化合物濃度成正比。螢光分光光度計是用於掃描液相螢光標記物所發出的螢光光譜的一種儀器。其能提供包括激發光譜、發射光譜以及螢光強度、量子產率、螢光壽命、螢光偏振等許多物理參數，從各個角度反映了分子的成鍵和結構情況。不但可以做一般的定量分析，而且還可以推斷分子在各種環境下的構象變化，從而闡明分子結構與功能之間的關係。
螢光分光光度計的工作過程是：由高壓汞燈或氙燈發出的紫外光和藍紫光經濾光片照射到樣品池中，激發樣品中的螢光物質發出螢光，螢光經過濾過和反射後，被光電倍增管所接受，然後以圖或數字的形式顯示出來。不同物質由於分子結構不同，而具有不同的螢光特徵，因此可以用螢光光譜的不同來定性地進行物質的鑑定和含量的定量分析。