螢光顯微鏡的工作原理主要基於螢光現象，即某些分子在吸收特定波長的光線（激發光）後，能再發射出其他波長的光線（發射光）。這一過程中，發射光的能量低於激發光，且波長通常較長。螢光顯微鏡使用紫外線或特定波長的光照射被螢光染料標記的樣品，激發樣品中的螢光物質發出可見光。
在結構上，螢光顯微鏡包括光源系統、成像系統和機械支持系統。光源系統產生激發光，照射到樣品上；成像系統包括聚光鏡、物鏡、目鏡，用於放大和觀察螢光圖像；機械支持系統確保顯微鏡的穩定性和結構支持。
螢光顯微鏡利用激發濾色片來過濾掉一部分光源中的可見光，只允許特定波長的激發光通過，照射到樣品上。樣品中的螢光物質吸收這些激發光後發出螢光，然後通過物鏡和目鏡放大，供觀察者觀察。阻斷濾色片用於阻止所有激發光的通過，只允許誘發的螢光通過，以減少干擾和保護觀察者的眼睛。
螢光顯微鏡的套用非常廣泛，包括細胞結構和功能的觀察、細胞化學成分的研究等。它能夠提供高對比度的螢光圖像，即使在強烈的背景下也能觀察到微弱的螢光。