硝酸甘油的製備歷史悠久，其首次合成是在1840年由義大利化學家Ascanio Sobrero完成的，當時是通過將甘油與硝酸和硫酸反應來製備。這一反應涉及到硝化過程，其中硝酸和硫酸混合形成混合酸，然後與甘油反應。
工業上製備硝酸甘油的過程則更為複雜，涉及多個步驟。首先，丙烯在高溫下與氯氣反應生成3-氯-1-丙烯。然後，通過水解、加成和再次水解的方法製得合成甘油。最後，通過酯化反應，甘油與硝酸反應得到硝酸甘油。
在實驗室中，硝酸甘油的製備可以通過硝化反應來完成。具體步驟包括將冷卻的發煙硝酸與濃硫酸混合形成混合酸，然後在低溫下滴加丙三醇。反應完成後，通過精製過程，包括水洗滌、乾燥劑除水和活性炭吸附，得到精製的硝酸甘油。
此外，硝酸甘油在歷史上曾被用作炸藥，但後來發現其具有治療心絞痛的效果。隨著時間的推移，硝酸甘油的作用機制被揭示，即身體細胞將硝酸甘油轉化為一氧化氮，導致血管擴張，從而用於治療心絞痛。