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地衣酚法

地衣酚法是一種用於測定RNA含量的方法,其基本原理如下:

反應原理:RNA在濃鹽酸的作用下發生降解,形成的核糖進一步轉化為糠醛。糠醛隨後與地衣酚(3,5-二羥基甲苯)反應,生成鮮綠色的複合物。在三氯化鐵或氯化銅的催化下,該反應更加靈敏。該反應產物在670納米波長處有最大吸收,且RNA濃度與光吸收值成正比。

特異性:地衣酚法的特異性較差,因為任何戊糖都會發生類似的反應。這意味著DNA和其他雜質也可能與地衣酚產生類似的顏色反應,從而影響測定的準確性。因此,在測定RNA含量時,可能需要先測定並扣除DNA的含量。

操作步驟:

製備標準曲線:使用不同濃度的RNA標準溶液,與地衣酚試劑反應,測定670納米處的光吸收值,繪製標準曲線。

樣品測定:將樣品與地衣酚試劑反應,測定670納米處的光吸收值,根據標準曲線計算RNA含量。

注意事項:

如果樣品中蛋白質含量較高,應先用5%三氯乙酸溶液沉澱蛋白質後再進行測定。

由於地衣酚法對DNA和其他雜質的干擾較為敏感,可以通過在試劑中加入適量的CuCl2·2H2O來減少DNA的干擾。

反應產物在670納米處有最大吸收,但DNA在600納米處也有吸收,可以通過比較兩個波長的吸收值來區分RNA和DNA的貢獻。

通過以上步驟,可以有效地使用地衣酚法來定量測定RNA的含量。