多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）的工作原理基於非線性光學現象，即樣品在接受到超過一個光子的能量時產生的螢光。具體來說：
激發光源：使用超短飛秒脈衝雷射器作為光源，這種雷射器能夠產生高能短脈衝，提高了樣品中兩個或多個光子同時到達同一位置（即螢光團分子）的機率。
多光子吸收：當染料分子在極短時間內吸收兩個或更多個光子能量後，會被激發到激發態。從激發態回到基態時，分子以螢光的形式釋放能量，這就是多光子螢光產生的基本原理。
成像特點：
三維層析成像能力：由於多光子螢光僅在聚焦點產生，這使得多光子顯微鏡具有三維層析成像的能力，能夠避免單光子螢光（線性激發）中離焦信號帶來的背景噪聲。
深層組織成像：使用的較長波長（如雙光子激發時的兩倍正常激發波長）能夠更深地穿透樣品進行3D成像，同時不會對樣品造成損害，延長了樣品的壽命。
技術優勢：
高解析度：由於多光子激發過程的高階非線性特性，螢光強度與激發光強度的二次方（雙光子吸收）或三次方（三光子吸收）成正比，這有助於提高成像的解析度和對比度。
低光損傷：使用超短脈衝雷射器減少了光對樣品的潛在損害，適用於對活體組織進行長時間觀察。
綜上所述，多光子顯微鏡通過其獨特的光源設計、非線性光學效應以及三維層析成像能力，為生物醫學研究提供了高解析度、低光損傷的成像解決方案。