底物磷酸化作用，又稱底物水平磷酸化，是指在生物氧化過程中，某些物質脫氫或脫水後形成的高能代謝中間產物，這些高能中間產物能夠直接將它們的能量轉移給ADP(腺苷二磷酸)或GDP(鳥苷二磷酸)，從而合成ATP(腺苷三磷酸)或GTP(鳥苷三磷酸)。這種磷酸化作用不依賴於氧分子，也不經過電子傳遞鏈。
例如，在糖酵解過程中，3-磷酸甘油醛脫氫生成1，3-二磷酸甘油酸，這是一個高能化合物，它隨後將高能磷酸基團轉移給ADP，生成3-磷酸甘油酸和ATP。這種磷酸化作用是細胞內能量轉換的一種重要方式，尤其在無氧條件下，它為細胞提供能量。