引物的合成通常採用固相亞磷醯胺三酯法技術進行人工合成。這種方法涉及以下步驟：
固相載體：合成以孔徑玻璃球為固相載體，這些玻璃球預先連線有活性基團被保護的核苷酸。
脫保護：第一步是將預先連線在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。
縮合反應：合成DNA的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體。這箇中間體的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。
帶帽(capping)反應：在縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應（少於2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其後繼續發生反應。這種短片段可以在後續環節根據實驗需要來選擇純化方式分離掉。
氧化反應：在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。再以三氯乙酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT。
重複循環：重複以上步驟，直到所有要求合成的鹼基被接上去。
切割和純化：通過氨水高溫處理，連線在CPG上的引物被切下來。然後通過OPC, PAGE等手段純化引物。成品引物用C18濃縮，脫鹽，沉澱。沉澱後的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。
這個過程確保了引物的純度高、序列長、效果好。DNA合成儀有多種，無論採用什麼機器合成，合成的原理都相同，主要差別在於合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。