螢光光度計的工作原理主要基於螢光物質的特性。當螢光物質吸收特定波長的光（激發光）後，其電子會從基態躍遷到激發態，處於激發態的電子不穩定，會重新回到基態，並在此過程中釋放出能量，通常以光的形式（螢光）發出。這個過程中釋放的螢光強度與樣品中相應物質的濃度成正比，因此，通過測量螢光強度可以分析樣品中特定物質的濃度或性質。
螢光光度計通常包含以下主要部件：光源（如高壓汞燈或氙燈）、激發單色器（用於選擇特定波長的激發光）、樣品室、發射單色器（用於選擇特定的螢光波長）以及光檢測器。儀器通過這些部件共同協作，以測量和分析螢光物質的螢光強度和波長分布。