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降落pcr原理

降落PCR(Touchdown PCR)是一種PCR技術,旨在通過最佳化退火溫度來提高反應的特異性。其基本原理如下:

初始階段。在最初的幾個循環中,退火溫度設定得比引物的Tm(熔解溫度)高15℃左右,這有助於確保引物與模板DNA的特異性結合,避免非特異性產物的形成。

逐漸降低退火溫度。在接下來的循環中,每個循環退火溫度降低1℃或數℃,直至達到一個較低的退火溫度,通常低於引物的Tm值2℃到5℃。這種方法不僅提高了擴增的特異性,而且隨著循環的進行,逐漸降低的退火溫度還提高了擴增效率。

提高特異性。由於在初始的高溫循環中,特異性產物的量首先達到一定豐度,因此在後續的低溫擴增循環中,即使特異性降低,非特異位點結合的競爭力仍然低於特異性位點,從而產生單一占主導地位的特異性擴增產物。

降落PCR不僅提高了PCR反應的特異性,還通過在初始循環中使用較高的退火溫度來避免引物二聚體和非特異性產物的形成。隨著循環的進行,通過逐漸降低退火溫度,可以提高擴增效率。這種方法特別適用於那些需要從複雜模板中特異性擴增特定序列的情況,如基因表達研究、疾病診斷和法醫學等。