X射線螢光光譜儀的工作原理是利用初級X射線光子或其他微觀粒子激發待測物質中的原子，使原子內的電子發生躍遷，從而產生具有特徵能量的次級X射線（螢光X射線），通過對這些次級X射線的能量和強度進行分析，可以確定樣品中元素的種類、含量和化學狀態。
在操作過程中，樣品首先被放置在X射線照射下，X射線管產生的高能X射線穿透樣品，導致樣品中的原子內層電子被激發，發生電子躍遷，當電子回到低能量軌道時，會以發出具有特定能量特徵的X射線（即螢光X射線）的形式釋放能量，這些螢光X射線的能量和強度與樣品中元素的種類、含量和化學狀態密切相關。
探測系統隨後測量這些螢光X射線的能量和強度，並將數據轉換成電信號，經過放大、濾波和數位化處理後，由計算機分析生成螢光X射線光譜圖，從而確定樣品中元素的類型和濃度。此外，根據莫斯萊定律，螢光X射線的波長或能量與元素的原子序數有關，這為元素定性分析提供了基礎，而螢光X射線的強度與相應元素的含量有一定的關係，使得可以進行元素定量分析。