吉他的定音，也稱為吉他定弦，是指為吉他空弦賦予的音高，通常用西方音樂中的具體音符來表示。標準定弦中，各弦的音高從低到高分別為E、A、D、G、B、E，這是吉他最常用的定音方式。
除了標準定音，還有其他的定音方法，如：
將第六弦降低為D音，形成DADGBE的調音方式，這樣在演奏D調的樂曲時非常方便。
一些彈重型音樂的吉他手會為了追求低沉和壓迫感的金屬音色，將標準定弦整體下調一個小三度或大三度。
按調定弦，例如D調定為DAD升FAD，E調定為EBE升GBE等，這種定弦方式適合用滑棒演奏。
定音的方法包括：
泛音定音。利用琴弦的泛音來對琴弦進行定音，泛音是琴弦振動時產生的倍頻振動，通過在琴弦上特定位置敲擊可以產生清晰的泛音。
聽覺定音。通過聽覺來感知琴弦的音高，這種方法需要演奏者具備較好的聽覺能力和音感。
定音的過程包括：
準備工具。確保有一個吉他調音器，這是一個幫助準確調整音高的小工具。
松弦。如果吉他之前已經被定過弦，先將它們全部鬆掉。
安裝新弦。將新的吉他琴弦插入相應的弦軸中，並固定好。
開始調音。使用吉他調音器，根據指示調整每一根弦的音高。
細緻調整。完成所有弦的初步調音後，再檢查一遍，確保各弦的音高準確無誤。
拉伸弦線。將各弦稍微用手拉伸一下，然後重新調音，以保持穩定的音準。
如果沒有調音器或其他參考工具的情況下，可以採用「模仿調音」法，先將吉他的一根弦調至已知音高的參考音，然後根據這個參考音來調整其他弦的音高。