臭氧殺菌的原理主要基於其強氧化性。臭氧分子極不穩定，能夠分解產生氧化能力極強的單原子氧和羥基。這些活性氧物質能夠迅速融入細胞壁，破壞細菌、病毒等微生物的內部結構。具體來說，臭氧殺菌的作用機制包括：
氧化分解酶：臭氧能氧化分解細菌內部葡萄糖所需的酶，使細菌滅活死亡。
破壞細胞器和核酸：作用於細菌細胞內的核物質，如核酸中的嘌呤和嘧啶，破壞它們的細胞器和DNA、RNA，導致細菌的新陳代謝受到破壞。
改變細胞通透性：與細菌細胞壁的脂類雙鏈反應，透過細胞膜組織侵入細胞內，作用於外膜的脂蛋白和內部的脂多糖，使細菌發生通透性畸變而溶解死亡。
損傷病毒蛋白：作用於病毒的衣體殼蛋白的四條多肽鏈，並使RNA受到損傷，破壞形成它的蛋白質，導致病毒失去活性。
臭氧消毒的優點在於消毒效率很高，接觸時間短，不易對被消毒的物品產生影響。而且用於水消毒時不影響水的感官性狀，不產生有害副產物，還能夠除臭。然而，臭氧消毒的技術要求較高，操作難度大，且在水中的性狀不穩定，不易維持剩餘消毒劑，因此需要協同使用第二消毒劑以防止細菌的再次生長。
需要注意的是，臭氧對人體的呼吸道黏膜有一定刺激性，因此在使用時需要做好防護措施。