《貓和老鼠》的故事情節主要圍繞着一對常見的家貓湯姆和老鼠傑瑞而展開。湯姆有一種強烈的慾望，總是不斷努力的去捉同居一室的老鼠傑瑞，並不斷地努力驅趕着這位討厭的房客。儘管總是失敗，但湯姆在追逐中得到的樂趣遠遠超過了捉住傑瑞。同時，湯姆在片中經常使用斧頭、錘子、炸藥、鞭炮等暴力工具或陷阱來對付傑瑞。但傑瑞非常機靈，時而使湯姆的詭計適得其反，讓湯姆自食其果。在這部動畫中，沒有動物世界中恃強凌弱的殘酷，只有兩個鄰居之間的日常瑣事和紛爭。
此外，《貓和老鼠》還有一些特別的故事情節，例如，有一集，主人買回來一隻機器貓，看起來效率比湯姆高多了，而湯姆自然面臨兔死狗烹的結局。還有一集，湯姆老了，很多貓欺負他，那一次，一羣貓又把他的奶酪扔到外面了，他拖着行動不便的腿，把奶酪撿了起來，那些貓都笑他，他卻走到一箇都是蜘蛛網的洞前，把奶酪放在洞口，說了一句，你，還在嗎。這些故事情節都展現了湯姆和傑瑞之間的友情和智慧，以及他們生活中的各種趣事和紛爭。