《刺客信條3》的故事發生在1767年的英國殖民統治的美國殖民地，遊戲的主角是一位名叫Desmond的奴隸主，他的祖先曾是刺客組織“聖殿騎士”的成員。
在遊戲中，主角的祖先曾留下了一本記錄刺客技巧的書籍，這本名為“心靈之眼”的書幫助主角發現了自己擁有基因解鎖的先祖能力，他可以穿著祖先的刺客服裝，使用其擁有的暗殺技能來混入人群並暗殺敵人，而不會被人注意。
遊戲的主要敵人就是當時統治美國的英國政府，以及其走狗阿爾瓦雷斯，他們試圖通過暴力手段統治殖民地人民。主角在遊戲過程中揭開了美國殖民地歷史、奴隸制度與奴隸起義的真相，並最終與聖殿騎士與英軍展開激戰。