sgRNA（single guide RNA）是一種短的合成RNA，通常只有20個鹼基對（bp），它能夠與Cas9蛋白結合，形成複合物，用於基因編輯。在設計和合成sgRNA時，首先需要在基因組上找到PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列，這是Cas9蛋白切割位點的前序序列。PAM序列的形式是固定的，但不同菌種屬的Cas9蛋白對應的PAM序列形式可能不同。一個典型的PAM序列是-NGG，其中的「N」可以是A、T、C或G中的任何一個。
合成sgRNA的過程包括：
轉錄體系的準備：使用rnase-free water將體積補至300μl，然後加入等體積的酚•氯仿•異戊醇(25:24:1)混合，離心後取上清。
再次離心：加入300μl氯仿，充分混勻後離心，取上清。
沉澱RNA：將上清合併，加入2倍體積的異丙醇和1/10體積的3M NaAC（pH 5.2），在-80°C下沉澱過夜。
洗滌RNA：離心收集沉澱，用75%乙醇洗滌兩次。
溶解RNA：用20μl rnase-free water溶解RNA，進行電泳檢測質量和濃度測定。
合成得到的sgRNA是體外合成的高純度RNA，它可以與Cas9蛋白結合形成複合物，通過電轉、脂質體轉染、顯微注射等方式導入細胞。在細胞內，sgRNA和Cas9蛋白形成的複合物識別並綁定到基因組上的目標序列，Cas9蛋白在PAM序列前形成雙鏈斷裂（DSB），從而實現對目標基因的精確切割和編輯。