區分老鼠的公母主要通過以下幾個方法：
對於幼鼠，母鼠腹部左右兩側各有一列黑點，這是未發育的乳頭，而雄鼠則沒有。此外，剛剛長毛的小鼠也是通過這種方法分辨。
對於稍微大一些的小鼠，由於體毛日漸豐滿，遮蓋了性特徵，此時可以觀察肛門處來分辨。成年的老鼠中，雄鼠臀部有兩個明顯的睾丸，而雌鼠則有兩排乳頭。
對於性成熟的鼠，可以通過肛門和外生殖器之間的距離與特徵來鑑別。雌鼠的肛門和陰道之間距離較近，且呈現一無毛帶區；雄鼠的肛門和陰莖間的距離大致是雌性的2倍，該處可見明顯的陰囊並且長有被毛。此外，經產並授乳過的雌鼠腹部常可見明顯的乳頭。
對於3至12日齡的大鼠和小鼠，性別可以通過腹部的乳頭來鑑別。由於被毛尚未長全，可見雌鼠的乳頭非常明顯地排列於腹部兩側，而雄鼠則沒有。